近年来,由于 SARS、高致病性禽流感等新发传 染病不断出现,生物安全柜在越来越多的医疗、科研 领域装备使用, 特别是 Ⅱ级生物安全柜(ClassⅡ Biosafety Cabinets)应用更加普遍,购销量大幅度增长。生物安全柜性能的优劣直接影响到工作人员和 周围环境的安危,国内外始终对其防护能力的检测 评价给予了很高的重视。现有的美国标准、欧洲标 准以及我国制定的行业标准,均要求从人员保护、样 品保护、交叉污染防护等方面对其进行性能评价,评 价用指示生物主要为枯草杆菌黑色变种芽孢。细菌 芽孢的生产制备周期长,消毒困难,在实际使用中会 影 响 检 测 工 作 效 率 和 准 确 度。粘 质 沙 雷 菌 (Serratiamarcescens)是一种传统的空气生物学模式菌,具有菌落特征典型、培养方便的优点,很多学 者用其作为空气微生物学评价指标〔1〕。为研究粘 质沙雷菌在生物安全柜防护性能评价方面应用的可 能性,在实验室对比了粘质沙雷菌与枯草杆菌黑色 变种芽孢对气溶胶化的耐受性,改进了现有的检测 标准,使用新的指示菌对美国 NUA IRE公司生产的 Ⅱ级生物安全柜进行了系统的性能检测,并与用美 国 NF - 49得到的结果进行了对比研究,以建立一 种便捷可靠的检测方法。现将研究结果报告如下。 

1　材料与方法

1 . 1试验材料 试验指标菌为粘质沙雷菌(ATCC . 8039) ,枯草 杆菌黑色变种芽孢(ATCC . 9372) ,均为军事医学科 学院保藏菌种。培养基为普通营养琼脂培养基,胰 酶大豆琼脂培养基。 ⅡB2型全排式生物安全柜为美国 Nuaire公司 产品,额定进风风速 0 . 50m /s ,下送风速 0 . 36m /s, 按照美国 NF - 49标准进行形式检测和出厂检测合 格。气雾染菌用 TK - 2型气溶胶发生器; 微生物采 样器用 AG I- 10型(撞击式采样器)空气微生物采 样器和二级安德森式(裂隙式采样器)空气微生物 采样器; 气溶胶发生在专用气雾柜内进行。 

1 . 2试验方法 

1 . 2 . 1试验菌悬液制备　粘质沙雷菌取第 14代以 内培养物,取典型菌落接种于营养肉汤培养基,于 37℃, 160 rpm 震荡培养 24 h; 菌落计数后于 4℃保 存备用,实验时以磷酸盐缓冲液稀释至使用浓度。 枯草杆菌黑色变种芽孢悬液制备是取纯培养菌 种经增菌培养、分离培养,选取典型菌落接种营养肉 汤培养基, 37℃培养 24 h。取肉汤培养物均匀涂布 于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面,置 37℃培养 7 d。 经细菌芽孢染色镜检,确认芽孢形成率达 95%以 上,然后收取芽孢。将新收取的芽孢悬液用双层脱 脂纱布过滤,再经断链、以 3000 r /m in离心 10 m in, 反复离心清洗 3次; 再经过灭活繁殖体处理,活菌计 数即制成芽孢悬液, 4℃保存备用。 

1 . 2 . 2试验菌雾化和采样冲击损伤耐受性试验　将 两者菌悬液分别用磷酸盐缓冲液稀释为 6. 2 × 104 cfu /m l和 5 . 5 ×104 cfu /m l浓度,加 100m l于 TK - 2发生器中,在室温 28℃、以流量 8 L /min、压力 1 . 0 kg /cm2 条件下在洁净气雾柜内雾化不同时间。 分别从回流罐中取 1m l回流混合液,用平板涂布法 作活菌计数,计算各时间点菌液相对于原菌液的存 活率。实验各重复 5次,结果运用 SAS软件进行二 因素析因分析。

另将上述配制的两种菌悬液 10 m l分别加于 2 个 Porton式采样器中(每个采样器含 10 m l稀释液 和 1滴橄榄油抗泡剂) ,各菌一式 2份。采样器排气 口与抽气泵相连接,在洁净气雾柜内以 12 L /m in流 量分别冲击 5 m in和 30 min,然后从采样器内取样 与未经冲击的稀释菌液一并进行活菌计数,计数重 复 5次。结果以相对未经冲击稀释菌液的存活率表 示,运用 SAS软件进行具有一个重复测量因素的二 因素方差分析。 

1 . 2 . 3生物安全柜生物学评价　①实验环境本底 检测: 生物防护测试前,使用二级安德森式采样器在 实验室内和室外排风口处采样 10 m in,采样平板于 37℃培养 24 h。 ②人员和环境保护试验: 开启安全 柜待稳定运于行额定风速。在操作台面上方 10 cm 水平面 3排 7纵等距交叉点测其风速,取平均值为 下送气流速度。在安全柜前开口基线上方 5 cm 和 15 cm高度各取 7个水平等距点测量风速,取平均 值操作口内向气流速度。依次将气源、压力计、流量 计、气溶胶发生器用管道连接。将粘质沙雷菌悬液 用磷酸盐缓冲液稀释为 6. 2 ×104 cfu /m l冰浴放置, 加入气溶胶发生器。按照美国 NF - 49标准所述布 点方法,将气溶胶发生器放置于安全柜内,将一个模 拟手臂的金属圆筒置于操作台面中央,前开口围绕 模拟手臂安置 4个 AG I - 10型采样器,上方放置 2 个 AG I- 10型采样器,两侧放置 2个二级安德森式 采样器(图 1)。在生物安全柜排风管道出口中心位 置放置 1个二级安德森式采样器,采样器用支架支 起 5 cm,减少对排风口气流的干扰,测试步骤依照 美国 NF - 49标准进行。 TK - 2发生器工作压力 0 . 06MPa,流量 8 L /m in。AG I- 10型采样器采样流 量 12 L /min,二级安德森式采样器采样流量 28 . 3 L /m in。采样结束后收集 6个 AG I - 10型采样器中 的采样液,用 0 . 22 μ m 微孔滤膜过滤,滤膜转移于 普通琼脂平板,连同安德森式采样器内平板一并置 于 37℃培养 24 h,观察结果,记录细菌菌落形成单 位,计算细菌总数。试验重复进行 3次。每次试验 结束后彻底消毒安全柜内表面和检测间。③交叉 污染测试: 安全柜风速条件同上,将粘质沙雷菌悬液 用磷酸盐缓冲液稀释至 6 . 2 ×104 cfu /m l ,加入气溶 胶发生器。按照美国 NF - 49标准规定方法布点和 采样方案,在柜内侧面发生气溶胶进行攻击,分别在 距喷雾口 0 cm, 36 cm, 38 cm 处放置平板采样。左 右侧试验各重复 3次。 ④样品保护测试: 安全柜风 速条件同上,将粘质沙雷菌悬液用磷酸盐稀释液稀 释至 6. 2 × 106 cfu /m l ,加入气溶胶发生器。按照美 国 NF - 49标准规定的布点和采样方法(图 2) ,由安全柜气流屏障外侧发生气溶胶进行攻击,在操作 台面上放置平板采样。试验重复 3次。 ⑤风速改 变条件下人员保护和样品保护性能测试: 调节安全柜风机使进风速度减小约 0 . 05m /s, 下送风速度增大约 0 . 05 m /s ,依照方法②所述方法 进行人员保护和环境保护性能测试。按照相同方 法,将安全柜进风速度和下送风速度都减小约 0 . 05 m /s ,测定人员保护和环境保护性能; 将安全柜进风速度增大约 0 . 05 m /s ,下送风速度减小约 0 . 05 m / s ,测定样品保护性能。各项防护性能检测结果按照 美国 NF - 49的标准判别合格与否,型式检验结果 与厂商(Nuaire公司)提供的按照美国 NF - 4标准 进行的检测结果以配对设计四格表记录,运用 SAS 软件进行进行 F isher精确检验,分析本试验使用方 法的检测结果与美国标准规定方法是否有显著性差

2结果

2 . 1雾化和冲击损伤耐受性试验结果 经方差分析表明,枯草杆菌黑色变种芽孢经过 porton采样器冲击 30 min,其相对存活率只有 37%; 而粘质沙雷菌经 30 m in冲击, 其相对存活率为 88%,明显高于枯草杆菌黑色变种芽孢(表 1)。粘 质沙雷菌在本试验条件下对冲击损伤的耐受性较 强,冲击时间越短,存活率越高; 菌种与时间交互作 用(P >0 . 05)对观测结果的影响无显著性意义。

雾化对细菌存活影响试验结果表明,两种细菌 经气溶胶发生器雾化对其存活率具有一定影响。枯 草杆菌黑色变种芽孢经 30m in雾化,其相对存活率 为 53%; 粘质沙雷菌雾化 30 m in,其相对存活率为 89%,明显高于枯草杆菌黑色变种芽孢(表 2)。

一元方差分析结果显示,不同菌种之间和雾化 时间对存活率有显著影响(P <0 . 01) ,粘质沙雷菌 具有较好的耐雾化能力,雾化作用时间的增长对细菌存活率不利。由时间 -存活率曲线图(图 3)可 知,雾化作用进行 60 m in之后,各种细菌的存活率 都有较大幅度下降。

2 . 2生物安全柜生物学评价结果 实验环境中粘质沙雷菌本底检测结果菌落数均 为 0,说明该菌在自然界空气中不是优势菌株,不会 对检测产生干扰,以此为指示菌可以保证检测特异 性。 两台生物安全柜在不同风速下防护性能采用本 方法各重复检验 3次,结果均为合格(表 3),结果显 示此方法重复性良好。