生物安全柜(biological safety cabinets, BSCs)是利用空气净化技术 ,实现第一道物理隔离的技术产品 ,为操作原代培养物 、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时 ,用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料 ,使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的〔1〕。随着安全柜在病原微生物实验室中的广泛使用 , 测试及评价生物安全柜的防护性能越来越有必要。国内关于使用细菌评价生物安全柜防护性能的文献较多〔2-7〕,而关于使用病毒测试和评价生物安全柜防护性能的研究未见报道 。随着 SARS 、禽流感、甲型H1N1 等呼吸道病毒传染病的出现 ,病毒气溶胶传染病病例逐年增多 。目前在实验室对病毒气溶胶传染病的研究较多, 生物安全柜作为重要的防护屏障对于保障操作人员免受感染具有重要意义 。本研究旨在评价实验室正常使用的生物安全柜对病毒气溶胶的防护效果 ,并建立相应的测试方法 。

1 材料与方法

1 .1 材料

1 .1 .1 试验用菌种和噬菌体 大肠杆菌(ATCC13706),噬菌体 phiX 174(ATCC 13706-B1)。

1 .1 .2 培养基:普通营养琼脂培养基 、普通营养肉汤培养基。

1 .1 .3 主要仪器:BGI 气溶胶发生器、安德森二级微生物采样器、热球式风速仪、AGI-30 液体撞击式采样器 、裂隙式采样器 、噪声计、照度计、气流发烟器和安全柜生物防护性能测试仪。

1 .2 方法

1 .2 .1 物理指标测试 下降气流 、流入气流 、气流模型 、噪声 、照度的测试按照 YY 0569-2005《生物安全柜》

〔2〕的方法进行。

1 .2 .2 气溶胶发生液 冰箱中保存的噬菌体 phiX174 通过双层琼脂平板计数噬菌斑的方法确定噬菌体含量为 2 ×109pfu/ml , 将其稀释到 5 ×108pfu/ml、5 ×106pfu/ml、5 ×104pfu/ml ,分别用于人员保护、产品保护、交叉污染防护的测试 。

1 .2 .3 测试环境本底采样 对安全柜进行测试之前,先用安德森二级空气微生物采样器对被测安全柜所处环境本底进行采样, 以确定测试环境中是否含有待测试的噬菌体。采样流量 28 .3 L/min , 采样10 min 。

1 .2 .4 人员保护测试 (1)安全柜的运行状态 :测试时安全柜处于正常工作状态 。(2)测试方法 :盛有40 ml 噬菌体发生液(5 ×108pfu/ml)的 BGI 气溶胶发生器位于安全柜内两侧壁之间。 BGI 气溶胶发生器喷嘴的轴线在工作台面上方 35 cm 处, 喷嘴前端在前窗操作口内 10 cm 处, BGI 气溶胶发生器的流量10 L/min ,喷射方向平行于工作台面且正对前窗操作口 。圆筒(直径6 .3 cm)固定在安全柜工作台面上中心位置 ,一端贴着安全柜的后壁 ,另一端从安全柜的前窗操作口伸出安全柜至少 15 cm。圆筒轴线距工作台面7 cm 。6 个AGI-30 液体撞击式采样器呈左右对称放置在安全柜前 , 采样口正对安全柜 。2 个AGI-30 液体撞击采样器的采样口轴线相距 15 cm ,与圆筒上沿平齐 ,采样口前端距安全柜 6 .3 cm ;2 个AGI-30 液体撞击采样器采样口轴线相距 5 cm, 位于圆筒下沿 3 cm 的水平面上 ,采样口的前端距安全柜6 .3 cm;2 个 AGI-30 液体撞击采样器的采样口水平面在工作台面上方 36 cm 处, 采样口前端距安全柜5 cm, 采样口轴线距安全柜中线 15 cm 。液体撞击采样器的流量 12 .5 L/min 。2 个裂隙式采样器的采样口平面与安全柜工作台面平齐 , 采样口的垂直轴线在安全柜前方 15 cm 处 ,各距侧壁 20 cm。采样器流量为 28 .3 L/min 。一个阳性对照琼脂培养皿放在圆筒下, 并位于前窗进气格栅上方 1 cm , 使其对进气气流的干扰最小 。测试持续 30 min , 测试顺序见表1 。将 6 个 AGI-30 液体撞击采样器的采样液体, 于无菌条件下, 倒入营养琼脂平板上 。然后加入宿主菌及上层半固体培养基, 凝固后 37 .0 ℃培养 12 ～5 ×106pfu/ml、5 ×104pfu/ml ,分别用于人员保护、产品保护、交叉污染防护的测试 。

2 .1 防护性能物理指标测试 在测试过程中安全柜处于正常工作状态 。结果表明 ,各项防护性能物理指标检测结果均符合标准的要求(见表2)。

2 .2 环境本底采样测试 结果表明,在安德森二级采样器的 2 个采样平皿中未见噬菌体 phiX 174 , 可见在测试环境中没有待测的噬菌体 。

2 .3 人员保护测试 在人员保护试验标准中规定,每次全部液体撞击式采样器的噬菌斑数应不超过10 pfu ,所有裂隙采样器的噬菌斑数应不超过 5 pfu 。人员保护测试结果表明 ,阳性对照培养皿 >300 pfu ;3 次裂隙式采样器实验结果全部 <5 pfu ;3 次AGI-30液体撞击采样器实验结果全部<10 pfu ,可见用 2 种采样方式各经3 次人员保护实验测试的结果均符合标准要求(见表 3)。

3 讨论

生物安全柜是生物安全实验室中使用最频繁的仪器设备之一, 直接关系到操作人员、环境及样品的安全 。本实验使用噬菌体 phiX 174 代替有传染性的病毒 ,测试了生物安全柜对病毒气溶胶的防护性能 ,测试的方法和评价指标等采用标准中细菌气溶胶防护性能的方法和指标 。在人员保护 、产品保护 、交叉污染防护实验中 ,病毒气溶胶发生液分别使用 5 ×108、5 ×106、5 ×104pfu/ml 3 种含量, 这是根据标准中细菌气溶胶发生液浓度要求而设计的 。本次研究结果表明 ,所测试的生物安全柜物理防护指标 、人员保护 、产品保护 、交叉污染的防护指标都符合标准的要求 。

目前, 国内外对于测试安全柜性能的实验以采用细菌为主〔2-7〕,而采用病毒气溶胶评价安全柜防护性能的研究尚未见报道 。有关生物安全柜对病毒气溶胶防护性能应该受到重视 。生物安全实验室中的安全设备除了生物安全柜以外, 还包括安全罩以及高压灭菌器等消毒设备。此外, 生物安全还包括个人防护 、实验动物防护、操作技术规范、病原微生物菌(毒)种管理等一系列综合措施 。