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用粘质沙雷菌试验评价II级生物安全柜的研究

[导读]粘质沙雷菌具有良好的雾化和冲击耐受性, 受检的安全柜的人员、样品和环境防护作用合格, 本研究建立的检测验证方法灵敏性和重 复性与美国标准(NF - 49)一致。

近年来 ,由于 SARS、高致病性禽流感等新发传染病不断出现,生物安全柜在越来越多的医疗 、科研领域装备使用, 特别是 Ⅱ级生物安全柜 (C lassⅡB iosafety C abine ts)应用更加普遍, 购销量大幅度增长。生物安全柜性能的优劣直接影响到工作人员和周围环境的安危, 国内外始终对其防护能力的检测评价给予了很高的重视 。现有的美国标准、欧洲标准以及我国制定的行业标准 ,均要求从人员保护 、样品保护、交叉污染防护等方面对其进行性能评价 ,评价用指示生物主要为枯草杆菌黑色变种芽孢 。细菌芽孢的生产制备周期长 ,消毒困难 ,在实际使用中会影 响 检 测 工 作 效 率 和 准 确 度 。 粘 质 沙 雷 菌(Serra tia marcescens )是一种传统的空气生物学模式菌, 具有菌落特征典型 、培养方便的优点 , 很多学者用其作为空气微生物学评价指标〔1〕。为研究粘质沙雷菌在生物安全柜防护性能评价方面应用的可能性, 在实验室对比了粘质沙雷菌与枯草杆菌黑色变种芽孢对气溶胶化的耐受性 ,改进了现有的检测标准,使用新的指示菌对美国 NUA IRE公司生产的Ⅱ级生物安全柜进行了系统的性能检测, 并与用美国 NF - 49得到的结果进行了对比研究, 以建立一种便捷可靠的检测方法。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1. 1试验材料

试验指标菌为粘质沙雷菌 (ATCC. 8039), 枯草杆菌黑色变种芽孢 (ATCC. 9372), 均为军事医学科学院保藏菌种。培养基为普通营养琼脂培养基 ,胰酶大豆琼脂培养基。

Ⅱ B2型全排式生物安全柜为美国 Nua ire公司产品, 额定进风风速 0. 50 m /s, 下送风速 0. 36 m /s,按照美国 NF - 49标准进行形式检测和出厂检测合格 。气雾染菌用 TK - 2型气溶胶发生器;微生物采样器用 AG I - 10型 (撞击式采样器 )空气微生物采样器和二级安德森式 (裂隙式采样器)空气微生物采样器 ;气溶胶发生在专用气雾柜内进行 。

1. 2试验方法

1. 2. 1 试验菌悬液制备 粘质沙雷菌取第 14代以内培养物, 取典型菌落接种于营养肉汤培养基, 于37℃, 160 rpm 震荡培养 24 h;菌落计数后于 4℃保存备用 ,实验时以磷酸盐缓冲液稀释至使用浓度。枯草杆菌黑色变种芽孢悬液制备是取纯培养菌种经增菌培养、分离培养, 选取典型菌落接种营养肉汤培养基, 37℃培养 24 h。取肉汤培养物均匀涂布于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面 ,置 37℃培养 7 d。经细菌芽孢染色镜检 , 确认芽孢形成率达 95%以上 ,然后收取芽孢。将新收取的芽孢悬液用双层脱脂纱布过滤 ,再经断链 、以 3000 r /m in离心 10 m in,反复离心清洗 3次 ;再经过灭活繁殖体处理,活菌计数即制成芽孢悬液, 4℃保存备用 。

1. 2. 2 试验菌雾化和采样冲击损伤耐受性试验 将两者菌悬液分别用磷酸盐缓冲液稀释为 6. 2 ×104cfu /m l和 5. 5 ×104cfu /m l浓度 ,加 100 m l于 TK- 2发生器中 , 在室温 28℃、以流量 8 L /min、压力1. 0 kg /cm

2 条件下在洁净气雾柜内雾化不同时间 。

分别从回流罐中取 1 m l回流混合液, 用平板涂布法作活菌计数 ,计算各时间点菌液相对于原菌液的存活率。实验各重复 5次, 结果运用 SAS软件进行二因素析因分析。

另将上述配制的两种菌悬液 10 m l分别加于 2个 Porton式采样器中 (每个采样器含 10 m l稀释液和 1滴橄榄油抗泡剂 ),各菌一式 2份。采样器排气口与抽气泵相连接 ,在洁净气雾柜内以 12 L /m in流量分别冲击 5 m in 和 30 min, 然后从采样器内取样与未经冲击的稀释菌液一并进行活菌计数, 计数重复 5次。结果以相对未经冲击稀释菌液的存活率表示, 运用 SAS软件进行具有一个重复测量因素的二因素方差分析 。

1. 2. 3生物安全柜生物学评价 ① 实验环境本底检测 :生物防护测试前, 使用二级安德森式采样器在实验室内和室外排风口处采样 10 m in,采样平板于37℃培养 24 h。 ②人员和环境保护试验:开启安全柜待稳定运于行额定风速。在操作台面上方 10 cm水平面 3排 7纵等距交叉点测其风速 ,取平均值为下送气流速度 。在安全柜前开口基线上方 5 cm 和15 cm高度各取 7个水平等距点测量风速 , 取平均值操作口内向气流速度 。依次将气源、压力计、流量计、气溶胶发生器用管道连接。将粘质沙雷菌悬液用磷酸盐缓冲液稀释为 6. 2 ×104cfu /m l冰浴放置,加入气溶胶发生器 。按照美国 NF - 49标准所述布点方法,将气溶胶发生器放置于安全柜内,将一个模拟手臂的金属圆筒置于操作台面中央 ,前开口围绕模拟手臂安置 4个 AG I - 10型采样器 , 上方放置 2个 AG I - 10型采样器 ,两侧放置 2个二级安德森式采样器(图 1)。在生物安全柜排风管道出口中心位置放置 1个二级安德森式采样器 , 采样器用支架支起 5 cm,减少对排风口气流的干扰 , 测试步骤依照美国 NF - 49 标准进行。 TK - 2 发生器工作压力0. 06 M Pa,流量 8 L /m in。 AG I - 10型采样器采样流量 12 L /min, 二级安德森式采样器采样流量 28. 3L /m in。采样结束后收集 6个 AG I - 10型采样器中的采样液 ,用 0. 22 μm 微孔滤膜过滤 , 滤膜转移于普通琼脂平板 ,连同安德森式采样器内平板一并置于 37℃培养 24 h, 观察结果, 记录细菌菌落形成单位, 计算细菌总数。试验重复进行 3次 。每次试验结束后彻底消毒安全柜内表面和检测间 。 ③ 交叉污染测试 :安全柜风速条件同上, 将粘质沙雷菌悬液用磷酸盐缓冲液稀释至 6. 2 ×104cfu /m l,加入气溶胶发生器 。按照美国 NF - 49标准规定方法布点和采样方案 ,在柜内侧面发生气溶胶进行攻击 ,分别在距喷雾口 0 cm, 36 cm, 38 cm 处放置平板采样。左右侧试验各重复 3 次。 ④样品保护测试 :安全柜风速条件同上,将粘质沙雷菌悬液用磷酸盐稀释液稀释至 6. 2 ×106cfu /m l, 加入气溶胶发生器。按照美国 NF - 49标准规定的布点和采样方法 (图 2), 由安全柜气流屏障外侧发生气溶胶进行攻击 , 在操作台面上放置平板采样 。试验重复 3 次。 ⑤风速改变条件下人员保护和样品保护性能测试:调节安全柜风机使进风速度减小约 0. 05 m /s,下送风速度增大约 0. 05 m /s, 依照方法 ②所述方法进行人员保护和环境保护性能测试 。按照相同方法 ,将安全柜进风速度和下送风速度都减小约 0. 05m /s, 测定人员保护和环境保护性能 ;将安全柜进风速度增大约 0. 05 m /s,下送风速度减小约 0. 05 m /s,测定样品保护性能 。各项防护性能检测结果按照美国 NF - 49的标准判别合格与否 , 型式检验结果与厂商(Nuaire公司)提供的按照美国 NF - 4标准进行的检测结果以配对设计四格表记录 ,运用 SAS软件进行进行 F isher精确检验 ,分析本试验使用方法的检测结果与美国标准规定方法是否有显著性差别。

2 结果

2. 1雾化和冲击损伤耐受性试验结果

经方差分析表明, 枯草杆菌黑色变种芽孢经过porton采样器冲击 30 min,其相对存活率只有 37%;而粘质沙雷菌经 30 m in 冲击 , 其相对存活率为88%,明显高于枯草杆菌黑色变种芽孢 (表 1)。粘质沙雷菌在本试验条件下对冲击损伤的耐受性较强 ,冲击时间越短 , 存活率越高 ;菌种与时间交互作用 (P >0. 05)对观测结果的影响无显著性意义 。

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