生物安全柜是保证实验室生物安全的重要防护 设施，可以提供对人员、产品、环境的保护。省疾病 预防控制中心生物实验室担负着项目繁多、种类复 杂的检品，检验人员的防护措施主要靠生物安全柜。 为了解生物安全柜的防护性能，我们以本中心实验 室引进的美国LABCONCO 型Ⅱ级B1 型生物安柜为 代表，对其生物因子防护性能进行了检测和评价。 现将检测结果报告如下。

1 材料与方法

1. 1 试验材料 实验设备为 LABCONCO 型Ⅱ级 B1 型生物安 柜，为美国进口产品，位于本中心微生物实验室。 主要试验仪器有 TK －2 气溶胶发生器、安德森二级采样器、 AGI 液体撞击式采样器、热球式风速 仪、声级计、照度计和气流检查器等。 试验指标菌为枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372) 芽孢，由军事医学科学院消毒检测中心提供;采用胰 酶大豆琼脂培养基和胰酶大豆液体培养基，均为国 内市售产品。 模拟手臂所用的不锈钢圆筒是按照标准规定的 试验方法自行设计制作。 

1. 2 试验方法 

1. 2. 1 气溶胶发生液的制备 将枯草杆菌黑色变 种菌种接种于胰酶大豆琼脂培养基平板划线分离培 养后，挑取典型菌落接种于胰酶大豆营养肉汤培养 基中，于37℃ 培养24 h。取培养物均匀涂布于罗氏 瓶中营养琼脂培养基表面，置 37℃培养 7 d ，经细 菌芽孢染色镜检，确认芽孢形成率 ＞ 95% 时，收 取芽孢。将新收取芽孢悬液用双层脱脂纱布过滤， 3 000 r/min 离心 10 min，PBS 缓冲液反复清洗 3次; 灭活繁殖体，梯度稀释，活菌计数即成芽孢悬 液， 4℃保存备用。 

1. 2. 2 环境本底采样 在对安全柜作测试前，先对 实验室环境和安全柜进行清洁消毒，再用安德森二 级采样器对生物安全柜所在实验室环境本底进行采 样，以确定测试环境中是否含有与试验菌相同的细 菌。采样流量 28． 3 L/ min，采样 15 min，对采样平 板进行培养，观察和鉴定。 

1. 2. 3 人员保护测试 ① 调整好安全柜内气流: 将安全柜内气流速度设置为规定的标准值，让安全 柜处于工作状态。② 发生气溶胶:在 TK －2 气溶胶 发生器装入含菌量为 6. 5 × 108 /ml 的芽孢悬液 20 ml，置于安全柜内两侧壁之间，发生器喷嘴前端在前 窗操作口内 10 cm，其轴线在工作台面上方36 cm 处，以流量为7. 5 L/min，喷射方向平行于工作台面 且正对前窗操作口进行喷雾染菌。③ 采样: 将外径 为6. 3 cm 的不锈钢圆筒固定在安全柜工作台面上 中心位置，一端贴于安全柜的后壁，另一端从安全柜 的前窗操作口伸出安全柜至少15 cm，圆筒轴线距 工作台面7 cm;将6 个 AGI 液体撞击式采样器呈左 右对称放置在安全柜前，采样口正对安全柜; 其中 2 个采样器的采样口轴线相距15 cm、与圆筒上沿平 齐，另2 个采样器采样口轴线相距5 cm、位于圆筒 下沿3 cm 的水平面上，采样口前端距安全柜均为 6. 3 cm; 最后 2 个采样器的采样口水平面在工作台 面上方36 cm 处，采样口前端距安全柜5 cm，采样口 轴线距安全柜中线 15 cm;所有采样器的流量均以 12. 0 L/min 进行采样。将阳性对照琼脂培养基平 板布放在圆筒下，位于前窗进气格栅上方1 cm，作 沉降采样。④ 安德森采样器采样:将2 个安德森二 级采样器的采样口平面与安全柜工作台面平齐，采 样口的垂直轴线在安全柜前方15 cm 处，各距侧壁 20 cm;以采样器流量为 28. 3 L/min 进行采样。⑤ 测试顺序:首先启动安德森二级采样器采样， 5 min 后，再启动 TK － 2 气溶胶发生器，共喷雾染菌 6． 5 min; 第 6 min 启动 AGI 液体撞击采样器，采样5 min;30 min 后停止安德森二级采样器采样。⑥ 培 养:对 AGI 液体撞击采样器的采样液用一直径为 4. 7 mm、孔径0. 22 μm 滤膜进行过滤，取出滤膜置 于合适的培养基平板上;将贴有撞击采样器采样液 滤膜的平板、安德森采样器采样的平板以及各种对 照平板，均置于37℃培养 24 ～ 28 h 观察结果，进行 细菌查计数;试验重复3 次。⑦结果判定:平板上枯 草杆菌黑色变种芽孢生长数限制值符合以下条件判 定为合格:所有撞击采样器采样液滤膜平板上菌数 应≤10 cfu，安德森采样器采样平板上菌数应≤5cfu，阳性对照平板上菌数应 ＞ 300 cfu。试验重复 3 次，均符合要求。 

1. 2. 4 产品保护测试 ①调整好安全柜内气流: 将安全柜内气流速度设置为规定的标准值，让安全 柜处理工作状态。②采样准备:在安全柜的工作台 面上排满敞开的营养琼脂培养基平板50 个。将外 径为 6. 3 cm 圆筒固定在安全柜工作台面上的中心 区，一端贴住工作区的后壁，另一端从前窗操作口伸 出安全柜至少 15 cm，圆筒的轴线高于工作台面7 cm;将1 个阳性对照培养基平板放在圆筒下，位于 前窗进气格栅上方1 cm。③ 发生气溶胶:在 TK －2 气溶胶发生器装入含菌量为6. 5 ×106 /ml 的芽孢悬 液20 ml，安放在安全柜外，喷射轴在安全柜中心并 与前窗操作口上沿平齐，喷嘴前端位于前窗操作口 外10 cm，喷雾方向平行于工作台面，正对前窗操作 口;启动 TK － 2 气溶胶发生器，流量为 7. 5 L/min， 喷雾5 min 后关闭。④ 采样:让所有打开的培养基 平板自然沉降10min，立即盖上平板盖，置于37℃培 养24 ～48 h 观察结果，进行菌落计数。试验重复 3 次。⑤ 结果判定:所有柜内实验组采样平板上的枯 草杆菌黑色变种芽孢菌数之和应≤5 cfu，阳性对照 采样平板上菌数应 ＞ 300 cfu，即可判定为合格。试 验重复3 次，均符合要求。 

1． 2． 5 交叉污染保护测试 ① 调整好安全柜内气 流:将安全柜内气流速度设置为规定的标准值，让安 全柜处于工作状态。② 气溶胶染菌准备: 在 TK －2 气溶胶发生器装入含菌量为6． 5 ×104 /ml 的芽孢悬 液20 ml，置于安全柜内，紧靠左侧内壁的中心，喷 射轴线在工作台面上 12 cm 处，喷射方向平行于工 作台面正对面的侧壁。③ 布放采样平板: 将敞开的 琼脂培养皿从前至后排列在工作台面上:2 排对照 培养皿位于 TK －2 气溶胶发生器喷嘴下方;距喷雾 器所在侧壁 36 cm 处放 1 排培养皿; 距喷雾器所在 侧壁36cm 外放2 排培养皿。④ 开启TK －2 气溶胶 发生器，以流量 7． 5 L/min，喷雾5 min 后关闭;自然 沉降20 min 采样，盖上平板盖。将所有采样平板置 于37℃培养24 ～28 h 观察结果，进行菌落计数。⑤ 另一侧重复:将喷雾器放于靠右侧内壁中央执行上 述步骤。⑥ 结果判定:距被检测侧壁 36 cm 外的采 样平板上枯草杆菌黑色变种芽孢菌数之和应≤2 cfu;距被检测侧壁36 cm 内的采样平板( 阳性对照) 的枯草杆菌黑色变种芽孢菌数之和 ＞ 300 cfu，即可 判定合格。安全柜的左右侧均各重复试验3 次，每 次试验结果均符合要求。 

1. 2. 6 下降气流流速测试 在工作区上方高于前 窗操作口上沿10 cm 的水平面上方呈等距离安排测量点，形成15cm ×15cm 的正方形栅格，测试点最少 应有3 排，每排 7 个测量点。测试区域边界与安全 柜的内壁及前窗操作口的距离应为15 cm。用风速 计探针准确定位在各测量点进行测量，记录各测量 值并计算平均值。结果判定:下降气流流速在0. 25 ～0. 5 m/s 之间为合格。 

1. 2. 7 流入气流流速测试 用风速计在前窗操作 口平面测量两排各点的气流流速，第一排在前窗操 作口上沿下1/4 开口高度位置;第二排在前窗操作 口上沿下约3/4 开口高度位置; 测量点间隔 10 cm， 距前窗操作口的侧边不少于10 cm，计算各测量值 的平均值。结果判定: Ⅱ级 B1 型安全柜流入气流 平均流速应≥0. 5 m/s。 

1. 2. 8 气流烟雾模式测试 ①下降气流测试: 烟 雾沿着工作表面的中心线，在前窗操作口顶端以上 10 cm 的高度，从安全柜的一端到另一端。②观察 窗气流测试: 烟在观察屏后 2. 5 cm、前窗操作口顶 端以上15 cm 高度从安全柜的一端到另一端; ③前 窗操作口边缘气流测试:烟在安全柜外大约3. 8 cm 处沿着整个前窗操作口的周界经过，特别应注意角 落和垂直边缘。④滑动窗密闭性测试:烟在滑动窗 内从距安全柜侧壁 5 cm 处沿工作区上沿经过。⑤ 结果判定: A． 下降气流和观察窗气流:工作区内的 气流应向下，不产生旋涡和向上气流且无死点，气流 不从安全柜中逸出。B． 前窗操作口边缘气流气流: 应不从安全柜中溢出。C． 滑动窗密闭性: 前窗操作 口整个周边气流应向内，无向外逸出的气流。前窗 操作口流入气流应不进入工作区。 

1. 2. 9 噪声测试 ①打开安全柜的风机和照明灯， 在安全柜前壁中心水平向外30 cm、工作台面上方 38 cm 处测量噪声。②关闭安全柜的风机和照明 灯，在相同位置测量背景噪声; ③当背景噪声大于 57 dB( A) 时，实测值按规定进行修正。④结果判 定: ≤67 dB( A) 。 1. 2. 10 照度测试 在工作台面上，沿工作台面两 内侧壁中心连线布点，测量点之间距离不超过 30 cm，与侧壁最小距离为 15 cm;关掉安全柜的灯，从 一侧起依次在测量点进行背景照度测量。打开灯、 启动风机，从一侧起依次测量台面照度。结果判定: 平均照度≥650 lx，最低照度≥430 lx。

2 结果

2. 1 环境本底采样测试结果 经安德森二级采样器对安全柜所在环境进行的 采样，所有平板上没有枯草杆菌黑色变种芽孢生长。

2． 2 人员保护测试结果

3 次试验结果表明，所有 AGI 液体撞击采样器 采样液接种的平板上生长的枯草杆菌黑色变种芽孢 菌数均符合≤10 cfu/皿，安德森采样器采样平板上 生长的枯草杆菌黑色变种芽孢菌数均≤5 cfu/皿，阳 性对照平板上枯草杆菌黑色变种芽孢菌数 ＞ 300 cfu/皿的标准要求( 表 1) 。 2. 3 产品保护测试结果 连续 3 次试验，在生物安全柜外人工发生气溶 胶，布放在安全柜内工作台面上的共50 个采样平板 上采集到的枯草杆菌黑色变种芽孢菌数之和分别为 3、 1、 2 cfu，均符合≤5 cfu 的标准要求; 阳性对照平 板上生长的枯草杆菌黑色变种芽孢菌数分别为 315、 335、 360 cfu/皿，均符合 ＞ 300 cfu/皿的标准要 求( 表2) 。

经用不同仪器监测结果证明，该生物安全柜启 动运行条件下，流入气流流速、下降气流流速、气流 烟雾模式、噪声和照度等物理防护性能指标符合相 关标准的规定( 表4) 。

3 讨论 

目前，国内尚未出台生物安全柜的国家标准，国 内大多数生物安全柜都未能进行防护性能检测。 2006 年颁布实施的中国医药行业标准 YY0569 － 2005《生物安全柜》 〔1〕，是在参考美国标准 NSF49 － 2002〔2〕和欧洲标准 EN12469 － 2000〔3〕基础上制定， 其适用性有待大量检测与科学验证，以便更适合本 国国情。本次依照现有标准，对本中心已经使用 3 年时间的美国进口 LABCONCOⅡ级 B1 型生物安全 柜进行了人员保护、产品保护、交叉污染保护等生物 防护性能和气流烟雾模式、下降气流流速、流入气流 流速、噪声、照度等物理防护性能指标进行了检测。 检测结果证明，该生物安全柜生物和物理防护性能 都符合标准要求，与出厂时检测的结果一致，说明我 国行业标准 YY0569 －2005 检测方法具有较好的灵 敏性、可重复性和适用性。 人员保护测试布点都是设在安全柜气流屏障最 薄弱的位置，检测结果具有较好的代表性。由于在 安全柜内实验操作时，手臂能干扰气流，因此，四个 AGI 液体采样器采样点设在模拟手臂摆放的位置;上方的两个 AGI 液体采样器设在模拟人员操作时 口鼻所处位置，而 A GI 采样器结构亦设在模拟人员 呼吸的自然通气量和呼吸道生理曲度。Ⅱ级生物安 全柜的两侧前窗滑轨处容易引起气流紊乱，是气幕 屏障的另一个薄弱环节，因此在此处选用的两个安 德森采样器进行30 min 空气微生物采样，能灵敏地 监测外逸的气溶胶细菌含量。 因枯草杆菌黑色变种芽孢抗力强，国外 NSF49 －2002 和 EN12469 － 2000 两大生物安全柜标准都 将其作为生物安全柜生物防护性能检测的指示菌 株，但其制备较费时，且难以消毒，不利于仪器设备 的周转，不适宜现场连续检测工作;若环境中残留的 细菌芽孢消毒不彻底，容易造成后续检测的假阳性。 因此，选择易消毒、自然空气中的非优势菌株来代替 枯草杆菌黑色变种芽孢作为指示菌株，有待进一步 研究〔4〕。 另外，该行业标准中尚缺生物安全柜高效排风 过滤器生物气溶胶泄露的标准检测方法;而用风速 仪法测流入气流流速时，其采样方法需依据安全柜 分型不同而异，如 B2 型因排风管密闭根本无法测 量，因此，我国医药行业标准 YY0569 －2005 在一些 项目的检测方法上有待进一步完善。