生物安全柜( biological safety cabinets,BSCs)是利 用空气净化技术,实现第一道物理隔离的技术产品, 为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有 感染性的实验材料时,用来保护操作者本人、实验室 环境以及实验材料,使其避免暴露于上述操作过程 中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的〔1〕。 随着安全柜在病原微生物实验室中的广泛使用,测 试及评价生物安全柜的防护性能越来越有必要。国 内关于使用细菌评价生物安全柜防护性能的文献较 多（2-7〕,而关于使用病毒测试和评价生物安全柜防护 性能的研究未见报道。随着 SARS 、禽流感、甲型 H1N1 等呼吸道病毒传染病的出现,病毒气溶胶传染 病病例逐年增多。目前在实验室对病毒气溶胶传染 病的研究较多,生物安全柜作为重要的防护屏障对 于保障操作人员免受感染具有重要意义。本研究旨在评价实验室正常使用的生物安全柜对病毒气溶胶 的防护效果,并建立相应的测试方法。

1　材料与方法
1. 1　材料

1. 1. 1 　试验用菌种和噬菌体 　大肠杆菌( ATCC 13706) ,噬菌体 phiX 174( ATCC 13706-B1)。

1. 1. 2　培养基: 普通营养琼脂培养基、普通营养肉 汤培养基。

1. 1. 3　主要仪器: BGI 气溶胶发生器、安德森二级 微生物采样器、热球式风速仪、AGI-30 液体撞击式 采样器、裂隙式采样器、噪声计、照度计、气流发烟器 和安全柜生物防护性能测试仪。

1. 2　方法

1. 2. 1 　物理指标测试　下降气流、流入气流、气流 模型、噪声、照度的测试按照 YY 0569-2005《生物安 全柜》〔2〕的方法进行。

1. 2. 2　气溶胶发生液　冰箱中保存的噬菌体 phiX 174通过双层琼脂平板计数噬菌斑的方法确定噬菌 体含量为 2×109 pfu/ml, 将其稀释到 5×108pfu/ml、5×106 pfu/ml、5×104 pfu/ml,分别用于人员保护、产 品保护、交叉污染防护的测试。

1. 2. 3　测试环境本底采样　对安全柜进行测试之 前,先用安德森二级空气微生物采样器对被测安全 柜所处环境本底进行采样,以确定测试环境中是否 含有待测试的噬菌体。采样流量 28 . 3 L/min,采样 10 min 。

1. 2. 4　人员保护测试　( 1)安全柜的运行状态: 测 试时安全柜处于正常工作状态。( 2)测试方法: 盛有 40 ml 噬菌体发生液( 5×108 pfu/ml)的 BGI 气溶胶发 生器位于安全柜内两侧壁之间。BGI 气溶胶发生器 喷嘴的轴线在工作台面上方 35 cm 处,喷嘴前端在 前窗操作口内 10 cm 处,BGI 气溶胶发生器的流量 10 L/min,喷射方向平行于工作台面且正对前窗操 作口。圆筒(直径6. 3 cm)固定在安全柜工作台面上 中心位置,一端贴着安全柜的后壁,另一端从安全柜 的前窗操作口伸出安全柜至少 15 cm。圆筒轴线距 工作台面7 cm。6 个AGI-30液体撞击式采样器呈左 右对称放置在安全柜前,采样口正对安全柜。2 个 AGI-30 液体撞击采样器的采样口轴线相距 15 cm, 与圆筒上沿平齐,采样口前端距安全柜 6. 3 cm; 2 个 AGI-30 液体撞击采样器采样口轴线相距 5 cm,位于 圆筒下沿 3 cm 的水平面上,采样口的前端距安全柜 6. 3 cm; 2个 AGI-30 液体撞击采样器的采样口水平 面在工作台面上方 36 cm 处, 采样口前端距安全柜 5 cm,采样口轴线距安全柜中线 15 cm。液体撞击采 样器的流量 12. 5 L/min。2 个裂隙式采样器的采样 口平面与安全柜工作台面平齐,采样口的垂直轴线 在安全柜前方 15 cm 处,各距侧壁 20 cm。采样器流 量为 28. 3 L/min。一个阳性对照琼脂培养皿放在圆 筒下, 并位于前窗进气格栅上方 1 cm, 使其对进气 气流的干扰最小。测试持续 30 min, 测试顺序见表 1。将 6个 AGI-30液体撞击采样器的采样液体, 于 无菌条件下, 倒入营养琼脂平板上。然后加入宿主 菌及上层半固体培养基, 凝固后 37. 0 ℃培养 12～ 16 h,计数每个平皿的噬菌斑数。当对照皿中的噬 菌斑数大于 300 pfu 呈“阳性”时为实验有效。重复 测试3 次。

1. 2. 5 　产品保护测试　( 1)安全柜的运行状态: 测 试时安全柜处于正常工作状态。( 2)测试方法: 在安 全柜的工作台面上摆满敞开的琼脂培养皿。圆筒 (直径 6. 3 cm)固定在安全柜工作台面上的中心区, 一端贴住工作区的后壁,另一端从前窗操作口伸出 安全柜至少 15 cm,圆筒的轴线高于工作台面 7 cm。 将盛有 40 ml 含量为 5×106 pfu/ml 噬菌体发生液的 BGI 气溶胶发生器放在安全柜外,BGI 气溶胶发生器 喷射轴在安全柜中心并与前窗操作口上沿平齐,BGI 气溶胶发生器的喷嘴前端位于前窗操作口外10 cm, 喷雾方向平行于工作台面,正对前窗操作口。一个 阳性对照琼脂培养皿放在圆筒下,并位于前窗进气 格栅上方 1 cm 处, 使其对进气气流的干扰最小。 启动 BGI 气溶胶发生器, BGI 气溶胶发生器的流量 为 10 L/min ,5 min 后关闭喷雾,盖上琼脂培养皿。 将培养皿在安全柜中加入宿主菌及上层半固体培养 基,凝固后37. 0 ℃培养 12～ 16 h 后计数每个平皿的 噬菌斑数。重复测试 3 次。

1. 2. 6　交叉污染防护测试　( 1)安全柜的运行状 态: 测试时安全柜处于正常工作状态。( 2)试验方 法: ①将盛有 40 ml 含量为 5 ×104 pfu/ml 的噬菌体 发生液的 BGI 气溶胶发生器置于安全柜内,紧靠左 侧内壁的中心,BGI 气溶胶发生器喷射轴线在工作 台面上 12. 5 cm 处,喷射方向平行于工作台面正对 对面的侧壁。②按下列方式将敞开的琼脂培养皿从 前至后排列在工作台面上: 2 排对照培养皿位于 BGI 气溶胶发生器喷嘴下方; 距 BGI 气溶胶发生器所在 侧壁 36 cm 处放一排培养皿; 距 BGI 气溶胶发生器 所在侧壁36 cm 外放二排培养皿。 ③启动 BGI 气溶 胶发生器,5 min 后关闭 BGI 气溶胶发生器,BGI 气 溶胶发生器的流量为10 L/min。④15 min 后盖上培 养皿, 加入宿主菌及上层半固体培养基,凝固后于 37. 0 ℃培养 12～ 16 h,计数每个平皿的噬菌斑数。 ⑤将 BGI 气溶胶发生器放于靠右侧内壁中央,执行 上述②-④的步骤。重复测试 3次。

1. 2. 7 　高效过滤器泄漏测试　安德森二级采样器 放于高效过滤器排风口,在人员保护测试过程中启 动 AGI-30采样器的同时启动安德森二级采样器,采 样流量 28. 3 L/min,采样 10 min。采样平皿加入宿 主菌及上层半固体培养基,凝固后37. 0 ℃培养12～ 16 h,计数每个平皿的噬菌斑数。
2　结果
2. 1　防护性能物理指标测试　　 在测试过程中安全 柜处于正常工作状态。结果表明,各项防护性能物 理指标检测结果均符合标准的要求(见表2)。

2. 2 　环境本底采样测试　结果表明,在安德森二级 采样器的 2 个采样平皿中未见噬菌体 phiX 174,可 见在测试环境中没有待测的噬菌体。
2. 3　人员保护测试　在人员保护试验标准中规定, 每次全部液体撞击式采样器的噬菌斑数应不超过 10 pfu,所有裂隙采样器的噬菌斑数应不超过 5 pfu。 人员保护测试结果表明,阳性对照培养皿>300 pfu; 3 次裂隙式采样器实验结果全部<5 pfu; 3 次AGI-30 液体撞击采样器实验结果全部<10 pfu ,可见用 2 种 采样方式各经3 次人员保护实验测试的结果均符合 标准要求(见表 3)。

2.4 产品保护的生物学测试，产品保护实验标准中规定,所有培养皿上的噬菌体 phiX 174 噬菌斑数 应不超过 5 pfu 。产品保护测试表明,阳性对照培养 皿>300 pfu ,而产品保护 3 次测得的平皿噬菌斑总 和分别为 1、0、5 pfu, 测试结果均符合标准的要求 (见表 4)。

2. 5 　交叉污染防护生物学测试　交叉污染实验标 准中规定,距被检测侧壁 36 cm 外的所有培养皿上 的噬菌斑数应不超过 2 pfu。3次交叉污染防护测试 结果全部为0,均符合标准的要求。

2. 6　高效过滤器泄露测试　　 3 次高效过滤器泄露 测试结果表明,噬菌斑分别为 0、0、1 pfu ,高效过滤 器对测试噬菌体气溶胶的过滤效率>99. 999%。

3　讨论 　　生物安全柜是生物安全实验室中使用最频繁的 仪器设备之一,直接关系到操作人员、环境及样品的 安全。本实验使用噬菌体 phiX 174 代替有传染性的 病毒,测试了生物安全柜对病毒气溶胶的防护性能, 测试的方法和评价指标等采用标准中细菌气溶胶防 护性能的方法和指标。在人员保护、产品保护、交叉 污染防护实验中,病毒气溶胶发生液分别使用 5 × 108 、 5 ×106、5 ×104 pfu/ml 3 种含量,这是根据标准 中细菌气溶胶发生液浓度要求而设计的。本次研究 结果表明,所测试的生物安全柜物理防护指标、人员 保护、产品保护、交叉污染的防护指标都符合标准的 要求。 　　目前,国内外对于测试安全柜性能的实验以采 用细菌为主〔2-7〕,而采用病毒气溶胶评价安全柜防护性能的研究尚未见报道。有关生物安全柜对病毒气 溶胶防护性能应该受到重视。生物安全实验室中的 安全设备除了生物安全柜以外,还包括安全罩以及 高压灭菌器等消毒设备。此外,生物安全还包括个 人防护、实验动物防护、操作技术规范、病原微生物 菌(毒)种管理等一系列综合措施。