芽孢杆菌在学术和工业生产方面均具有很高的价值，它能形成孢子，易于繁殖保存，并能产生许多商业产品，如杀虫剂、抗生素和各种酶等，但是却很少有报道产透明质酸酶的芽孢杆菌。透明质酸酶在HA寡糖、硫酸软骨素等多聚糖的基础研究领域以及医药、美容等领域均具有显著的应用价值。由于动物来源透明质酸酶成本高，并有动物病毒感染的风险，因此希望使用更安全廉价的透明质酸酶。微生物来源透明质酸酶来源广，容易提取纯化，纯度高，不易产生免疫反应，深受人们青睐。

当透明质酸溶液暴露于空气中，由于空气中的细菌降解透明质酸，使其黏度降低。基于此，本文从空气中富集筛选得到一株透明质酸酶高产菌株，并鉴定为芽孢杆菌属的一个新种。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

分离自华熙福瑞达生物医药有限公司研发中心实验室空气沉降菌，得到一株编号为TF18的菌株，且此菌株能产透明质酸酶。

1.2 主要试剂与药品

1.2.1 生理生化实验用试剂：胰蛋白胨，酵母粉（OXOID）；肌酸，革兰染色试剂，Lugol碘液，斐林溶液，格里斯试剂，靛基质试剂，枸橼酸盐液体培养基等（海博生物）；脱脂奶粉；溴百里酚蓝，溴甲酚紫（天津大茂化学试剂厂）；溶菌酶，牛肉膏，明胶，NaCl，双氧水，葡萄糖，琼脂粉，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，D-木糖，L-阿拉伯糖，D-甘露醇，NaOH，可溶性淀粉，CaCO3，甘油，KNO3，酪氨酸，苯丙氨酸等（国药集团）。

1.2.2 16S rDNA克隆与测序用试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒，DNA分子量Marker（北京天恩泽基因科技公司）。

1.3 主要仪器

INFORS Multitron Standard恒温振荡培养箱（瑞士伊孚森）；DK-8D数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；3SK30型冷冻离心机（美国SIGMA）；PCR仪（北京卡尤迪）；电泳仪（北京百晶）；GeneGenius凝胶成像系统（美国BIO-RAD）；LAZX-40CI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安）；岛津UV-1800紫外分光光度计（日本SHIMADZU）；SW-CJ-1F洁净工作台（苏州安泰）。

1.4 数据库与软件

1.4.1 BLAST序列对比检索工具：

1.4.2 MEGA 5基因系统发育树构建软件

1.4.3 DNAMAN基因序列对比软件：

1.5 菌株TF18传统形态与生理生化鉴定

1.5.1 菌落形态特征 观察菌体在 LB 平板上的菌落形态特征。

1.5.2 菌体形态特征 革兰染色后在油镜下观察菌体形态并测量大小。

1.5.3 菌体的生理生化反应[1-2]

主要有耐盐度测定、生长温度测定、运动性试验、好气测定、其他生理生化实验。

1.6 菌株TF18 16S rDNA的PCR扩增和序列分析

1.6.1 基因组DNA的提取及16S rDNA的PCR扩增挑取待鉴定单菌落于50 mL LB液体培养基（50mL/250 mL）中，37 ℃培养24 h；取1.5 mL菌液12 000 r/min 离心2 min，弃上清。利用细菌基因组DNA提取试剂盒按操作说明书提取基因组DNA。

以提取的细菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。扩增体系50 μL：模板DNA 1 μL、正向引物27F（5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’）2 μL和反向引物1492R（5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’）2 μL、ddH2O 20 μL、Green PCR Master Mix(2×)25 μL。PCR反应程序：97 ℃，预变性2 min；97 ℃，变性1 min；55 ℃，退火1 min；72 ℃，延伸2min，30个循环；72 ℃，延伸10 min，PCR仪扩增。

1.6.2 16S rDNA基因测序与序列分析 取5 μLPCR扩增产物与Loading Buffer混匀，点样于1 %琼脂糖凝胶上，在0.5×TAE缓冲液中电泳，电压5 V/cm，经溴化乙锭染色10 min，凝胶成像仪观察，拍照，进行结果分析。

将PCR扩增产物（菌株TF18 16S rDNA）送深圳华大基因科技有限公司进行序列测定。获得菌株TF18 16S rDNA序列后，利用NCBI网站BLAST工具分析16S rDNA序列，在GenBank数据库中进行同源序列搜索和比对，从比对的高度同源序列中随机选取部分序列利用Mega 5.0构建系统进化树，同时通过DNAMAN软件计算各序列间相似性。

2 结果与分析

2.1 菌株TF18的形态特征

观察菌株TF18的菌落形态、革兰染色及芽孢染色等特征，结果见图1~3。结果表明，菌株TF18的菌落形态不规则，表面有褶皱，淡土黄色，直径2~5 mm，产淡土黄色色素。革兰染色显示，此菌为革兰阳性菌，杆状细菌，个体较大，长度约3~8 μm。芽孢染色表明此菌产芽孢，孢子囊明显膨胀，芽孢椭圆形，中生或次端生。

2.2 菌株TF18的生理生化特征

2.2.1 酸碱度测试 此菌株在含0.5 %~10 % NaCl

培养基中生长良好，最适NaCl浓度为0.5 %。

2.2.2 生长温度测试 本菌株最低生长温度为10 ℃，最高生长温度40 ℃。在34~37 ℃生长良好。

2.2.3 运动性试验 半固体穿刺培养显示此菌没有鞭毛，不能运动。

2.2.4 好气测定 该菌株在肉汤琼脂表面生长良好，故为好氧菌。

2.2.5 其他生理生化实验 能水解酪素，不能液化明胶，不分解酪氨酸，V·P试验反应阴性，能水解淀粉，产糊精结晶，接触酶阳性，对溶菌酶（0.001%）敏感，苯丙氨酸脱氨酶阴性，不能形成吲哚，硝酸盐还原试验阳性，不能从甘油产生二羟基丙酮，D-葡萄糖、D-甘露醇、D-木糖和L-阿拉伯糖产酸不产气，柠檬酸盐不利用（表1）。

上述结果表明，菌株TF18菌体杆状、好氧、具芽孢，应属于芽孢杆菌科（Bacillaceae）的芽孢杆菌属（Bacillus）。根据Gordon氏分类系统[2]，芽孢杆菌属分三大类群。菌株TF18芽孢囊明显膨胀，芽孢椭圆，革兰阳性，属于群2。

群2中环状芽孢杆菌（B. ciavculans）、蜂房芽孢杆菌（B. alvei）与TF18相似。但TF18厌氧反应阴性，V·P反应阴性，能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇产酸，硝酸盐还原反应阳性，不能产生二羟丙酮，不能产生吲哚，对溶菌酶敏感，而蜂房芽孢杆菌（B. alvei）则不同。与环状芽孢杆菌（B. ciavculans）比较，TF18能产生糊精结晶，硝酸盐还原反应阳性。

除群2这两种菌外，群1中的蜡状芽孢杆菌（B. cereus）、坚强芽孢杆菌( B. firmus)、巨大芽孢杆菌（B. megaterrium）以革兰染色、芽孢形状、芽孢着生位置、运动性、酪素水解、淀粉水解和硝酸盐还原等方面与TF18相似。但这3株菌与TF18的区别也很显著，如在含5 %NaCl、7 %NaCl肉汤培养基中能生长，芽孢囊不膨大等方面与TF18不同。

由上述结果可见，TF18不同于伯杰氏手册（第八版）中所列已知种，判定应为一新种。

2.3 菌株TF18的16S rDNA克隆与序列分析及系统发育树构建

通过PCR克隆了菌株TF18的16S rDNA，并进行了测序。序列结果表明，TF18的16S rDNA序列长1418 bp（图4）。将该序列提交GenBank数据库，利用BLAST工具对菌株TF18的16S rDNA进行比对，结果表明，其与芽孢杆菌属（Bacillus）多个菌株的16S rDNA序列同源性较高。

测序得到的菌株TF18的16S rDNA基因序列与同源性较大的芽孢杆菌(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，采用MEGA 5.0软件中的邻位相算法（N-J法）和bootstrap 1000次，构建TF1816S rDNA基因系统发育进化树，并确定其进化地位（图6）。同时通过DNAMAN软件对各序列进行比较，计算相似性（表2），相似性超过97%的菌株有Bacillus niacini train GN3，Bacillusniacini train M27，Bacillus niacini train AS2-8，Bacillus sp. W1-17。其中，与菌株Bacillus sp.W1-17相似性最高，达到98.67%。

3 结论与讨论

本文从自然界中筛得一株透明质酸酶高产菌株TF18，通过生理生化鉴定、16S rDNA序列的扩增、序列测定及系统发育树的构建，该菌株初步鉴定为芽孢杆菌属一新种，暂命名为Bacillus sp. TF18。生理生化鉴定结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）中芽孢杆菌属所列菌种均不吻合，并且其16S rDNA序列与所报道的序列也不相同，因此可确定是一株新菌种。

菌株Bacillus sp. TF18所产透明质酸酶酶活高达2811 U/mL（酶活单位检测方法参考《中国药典》2010年版）[3]，远高于市面上销售的透明质酸酶酶活，可用于工业化酶法生产低分子透明质酸（TMW-HA），寡聚透明质酸(o-HA)。由于透明质酸酶成本高、酶活低等原因制约，很少有报道将透明质酸酶应用于大规模生产低分子HA及oligo-HA，而透明质酸酶高产菌株的筛得可使之成为可能。因此对此菌种进行菌种鉴定是非常重要的，为后续工作奠定了理论依据。